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2008-09-25
·mRNA标记 生化标记技术 ]
问：mRNA地高新标记和生物素标记有那些方法?抽提mRNA后有什么方法可进行快速标记的？谢谢。
答：做RT-PCR得到DNA装到载体里，做体外转录。 ... [阅读全文 ]
2008-09-25
·免疫印迹法检测信号蛋白的三种显示系统比较 生化标记技术 ]
问：请问各位，碱性磷酸酶标记，与辣根过氧化物酶标记效果上有什么区别？我师姐们一直用碱性磷酸酶标记的，但我看现在大家都用辣根过氧化物酶标记的，所以想请教一下！
答：你可以看以下的文献： ... [阅读全文 ]
2008-09-25
·DNA探针标记常用试剂的配制 生化标记技术 ]
（1）10 ×缺口平移缓冲液：200mmol/l Tris-HCl，pH7.4含50mmol/L MgCl2；100mmol/Lβ-巯基乙醇、1mg/ml BSA。 （2）缺口平移反应终止液：200mmol/L NaCl；10mmol/l Tris-HCl，pH7.4；11mmol/L EDTA； 0.5% SDS。 （3）DNaseⅠ:干粉状DNaseⅠ(2000～30 ... [阅读全文 ]
2008-09-25
·地高辛配基随机标记DNA探针 生化标记技术 ]
1．标记DNA探针 每次标准的反应可标记10ng至3线性的DNA，也可标记更大量的DNA，但所有的成分和体积要相应增加。
（1）DNA探针热变性，煮沸10min，迅速冷却于冰/乙醇中5min以上，待用。
（2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及试剂：
新鲜变性的DNA 1-3
六聚核苷酸混合物 2（管5）
dNTP标记用混合底物 2（管6）
加无菌重蒸水至 19
D ... [阅读全文 ]
2008-09-25
·荧光素半抗原标记探针 生化标记技术 ]
非放射性物质标记核酸探针的方法通常是通过在核酸分子中引入诸如半抗原、生物素等惰性小分子。这些小分子一般通过连接到dUTP等核苷三磷酸上。这种经修饰的核苷三磷酸再通过酶促反应掺入到探针中，例如用于随机引物法标记长链探针或是通过末端转移酶标记寡核苷酸的3′端。
杂交后用与一种酶相连接的抗体（或者如果是生物素，则用链霉抗生物素蛋白streptavidin）来检测，这些酶如碱性磷酸酶或辣根过氧 ... [阅读全文 ]
2008-09-25
·荧光素酶检测 测序实验技术 ]
Introduction
Luciferase can be used as a reporter gene to measure the activity of promoters and/or the transfection efficiency.
Aims
You will be provided with the HEK293/COS cells that you transfected ... [阅读全文 ]
2008-09-25
·HRP标记 生化标记技术 ]
问：有没有做辣根过氧化物标记的朋友啊，能不能把你们的步骤发给我。本人开始做，发现很多人用的浓度都不一样。
答：1.1 试剂准备
1) 10mg/mL HRP
2) 0.06mol/L NaIO4
3) 0.16mol/L乙二醇
4) 碳酸盐缓冲液(Na2CO3 0.7952g NaHCO3 1.4702g 溶于500mL蒸馏水中，调pH值到9.5)
5) 2.5mg/mL NaBH4
6) 0.0 ... [阅读全文 ]
2008-09-25
·酶标记 生化标记技术 ]
问：我想知道，用什么方法进行酶标记可以非常有效呐？过碘酸钠标记怎么样？
答：第一节 间接法测抗体
基本原理
将特异性抗原包被在固相载体上，形成固相抗原，加入待检标本（含相应抗体），其中抗体与固相抗原形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体，亦称二抗），与上述抗原-抗体复合物结合。此时加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色（反应过程见图1－1）。
试剂与设备 纯化抗原。 ... [阅读全文 ]
2008-09-25
·FITC标记抗体流程 生化标记技术 ]
（1）将待交联的蛋白（浓度³1mg/ml）对交联反应液透析三次4 ℃，至pH＝9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。
（2） 将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。
（3） 按P:F（蛋白质：FITC）=1mg:150μg 的比例将FITC缓 ... [阅读全文 ]
2008-09-25
·荧光素FITC标记抗体的方法 生化标记技术 ]
当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下
FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → ... [阅读全文 ]
2008-09-25
·分子信标的原理、应用及其研究进展 生化标记技术 ]
摘要 分子信标技术是一种基于荧光共振能量转移现象（FRET）和碱基互补配对原则建立起来的一种分析技术。分子信标作为一种荧光标记的分子探针，具有极强的特异性和较高的灵敏度，目前已经成为基础医学和生物学的重要研究工具。本文着重介绍了分子信标的基本原理及其应用，并对其近年来的研究进展做以简单介绍。
1 引言
在基因时代和蛋白质时代，人们迫切需要一种具有高灵敏度和高亲和力的生物分子探针，用以进行定性和定量 ... [阅读全文 ]
2008-09-25
·分子信标的最新发展 生化标记技术 ]
1996年Tyagi和Kramer首次建立了分子信标探针，最初目的是能在液相中定量测定靶标的量。分子信标技术以其操作简单、灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时定量测定、甚至可以用于活体分析等特点不仅在生物学研究中有着广泛的应用，而且在疾病基因检测与诊断等生物医学基础和临床研究中也将充当重要的角色。近来，人们通过改变经典分子信标的结构，设计出许多新型的分子信标，如用ssDNA链做环、用RNA-DNA ... [阅读全文 ]
2008-09-25
·分子信标技术及其应用研究进展 生化标记技术 ]
Tyagi和Krammer于1996年设计了一种可以特异性识别核酸序列的新型荧光探针这种荧光探针通过与核酸靶分子进行杂交后发生构象的变化而发出荧光他们将其命名为分子信标(Molecular Beacon)。
分子信标具有背景信号低灵敏度高、特异识别性强、操作简单，不必与未反应的探针分离即可实时检测，可用于活体分析等优点。在生物化学分析，生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用价值。
分子信标的结构
... [阅读全文 ]
2008-09-25
·探针标记方法 生化标记技术 ]
探针标记方法有：
1、DNA的缺口平移法。缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。该技术可以制备序列特异的探针。当使用重组质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和凝胶电泳纯化后再进行缺口平移标记。此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。
2、DNA的随机引物法。这种方法是使用寡核苷酸引物和大 ... [阅读全文 ]
2008-09-22
·PC12细胞的其他问题 原代培养 ]
PC12传代的消化
丁香园wangpengljr的问题：
我最近养PC12细胞做分化方面的研究，但是遇到的难题是PC12细胞本身的贴壁能力就差（养PC12细胞最好是用Gibco的马血清，Hyclone的不贴壁！），最开始没有用胰酶处理，直接吹打下细胞发现成团现象，用0.02％EDTA的PBS吹打似乎不易成团，但是慢慢地细胞贴壁能力下降了，我用poly－Lys包被都不行。我之所以不用胰酶是因为怕胰酶 ... [阅读全文 ]
2008-09-22
·如何使PC12细胞贴壁更牢 原代培养 ]
丁香园ivy_mayan的问题：
在做PC12的H2O2损伤模型时，由于细胞经过H2O2的冲击，大多活性不好了，所以贴壁性变差，结果在测MTT时由于要去掉上清液，细胞会被一同吸走，这样所测吸光值就不准了，请问大家，怎么可以使PC12贴壁更牢（即使经过损伤冲击）？
丁香园george的观点：
1.细胞培养板的选择：一定要用进口的培养板，国产的大多贴不好。
2.尽量使细胞处于良好的状态，包括培养液要新 ... [阅读全文 ]
2008-09-22
·PC12细胞的分化 原代培养 ]
丁香园Ginkgokeer的问题：
未分化的PC12在什么情况下会使它产生分化，从而成为分化的PC12？？是不是NGF有这样的作用？除此以外呢？
丁香园sudajyou的观点：
pc12 在未分化时贴壁生长，但最好用5%HS 5%FBS/DMEM培养液，据说PC12在完全没有HS的培养液中贴壁不好。我用的是CORNING的培养皿，PC12贴壁很好。
丁香园忘记宝儿兔兔的问题：
关于pc12细胞即鼠 ... [阅读全文 ]
2008-09-22
·PC12细胞的图片 原代培养 ]
丁香园qincym：
【原创】PC12细胞
1.细胞种类：大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞
2.培养的天数：传代后2d
3.放大倍速：倒置显微镜 放大倍数：X100
4.培养基种类：RPMI1640培养基+10%胎牛血清；
5.细胞状态与特征简述:细胞贴壁生长，呈卵圆形或多边形细胞界限清楚，核分裂相明显，有伪足伸出，有的伪足较长甚至连接在一起细胞基本不透光倾向于呈小簇状生长 。
丁香园jackyhoi ... [阅读全文 ]
2008-09-22
·pc12细胞的生长特性 细胞百科 ]
丁香园Ginkgokeer的问题：
PC12细胞是什么细胞？或者说它的形态是什么样的？来源呢？
丁香园wack_lry的回答：
来自大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系，它与神经细胞在发生学上均来源于神经脊；在结构、功能上与神经元有很多相似之处，与神经元比较又相对容易培养，故普遍将PC12细胞用作研究神经的细胞模型。
丁香园balabom的问题：
才从别人那里拿来已传代的pc12养，感觉长得很快，两天就要 ... [阅读全文 ]
2008-09-22
·pc12培养 原代培养 ]
丁香园myl0605的观点：
前几天为自己养的PC12是未分化还是分化型困扰查了一些资料现发上来希望能给有同样问题的战友有一点帮助!
培养条件:ＰＣ12细胞培养于铺有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中置于ＣＯ2培养箱(37℃95%空气5%ＣＯ2)培养基选用ＤＭＥＭ(ｐＨ7.4高糖)加入10%灭活小牛血清及5%灭活马血清。
分化前:ＰＣ12细胞在培养基中多呈圆形直径15～20μｍ也有椭圆或多角形的扁平的细 ... [阅读全文 ]
2008-09-19
·测序引物 测序实验技术 ]
问：准备测序，要提供什么样品可以测序呢？另外测序需要提供什么样的引物嘛？是提供一条5‘端的引物就可以吗？设计测序引物有什么像PCR引物一类的要求吗？多谢！
答：测序可以提供PCR产物、带有目的基因的菌、质粒。如果是PCR产物，需提供1pM的PCR引物即可。如果是质粒，直接告诉他你用什么质粒就行了。一般都是送菌去测，自己提的质粒有时效果不好，PCR产物测序质量较低。
答：测序时根据不同 ... [阅读全文 ]
2008-09-19
·菌液PCR鉴定之后送测序无结果 测序实验技术 ]
问：我用DNA扩增基因的外显子，连接PMD载体后转化大肠杆菌感受态，菌液PCR鉴定出现目的片段。送测序。测不出来。是我的PCR假阳性？还是我的送测样品有问题？
答：菌液PCR假阳性高，我每次都提质粒后做酶切鉴定，这样准！也不排除测序公司问题，但是我决定搂主应该加强一下克隆筛选鉴定的力度，光菌液PCR结果就送测序了。 ... [阅读全文 ]
2008-09-19
·测序（3'端测序，5'端测序） 测序实验技术 ]
问：刚做克隆，遇见测序过程中 有3'端测序，5'端测序，到底是怎么回事？为什么有两个测序结果？我应该按那一个来看测序正确还是不正确？
答：测序都是从5'端进行的，正向和反向测序是指对DNA的两条互补链分别测序，通常两个方向测序结果经校读后完全一致才能认为得到可靠结果。一点测序经验：
1、测序选择引物很重要，一般的克隆载体现在都有通用引物，如T7SP6M13-47 RVM ....但选择哪个引物测序 ... [阅读全文 ]
2008-09-19
·PCR测序的疑惑 测序实验技术 ]
问：我将PCR未纯化送测序公司测序，片段大小是344BP 。双向测序。正向结果正常，反向为何是双峰呢？测序引物PAGE回收的。结果附上：
答：通过比对，mtectR引物测序的峰图下面的小峰串起来好像是mtectF引物测序的峰图，mtectR引物测序时很可能在做反应那一步混有痕量mtectF引物导致的，重新测序即可解决，另外不知你的引物在哪儿合成的，测序图谱上有些微的移码，每个峰图下面的小峰是后一 ... [阅读全文 ]
2008-09-19
·正反向测序结果不一致 测序实验技术 ]
问：本人现在的课题为扩增一段基因组DNA，产物直接测序。反向测序第100个碱基处为杂合子T/G，正向测序对应位置为A。重新扩增送样后测序结果相同。请问这种情况下可否判断第100个碱基处存在突变？如存在突变，为何两次正向测序结果均无突变？
答：确实很困惑，2次测序的结果应该都是可信的，关键是那个图1的G，在图2中应该同时表现为C。
1. 你可以在EGP数据库或者NCBI中检索，看该位点是否有SNP ... [阅读全文 ]
2008-09-19
·测序出现双峰的原因 测序实验技术 ]
问：本人拿菌液让生工测序，结果是双峰，是什么意思？怎么回事？重组的质粒用酶切鉴定没有问题。
答：1、有可能是基因重复，重复的两个拷贝之间有一个硷基的差异。样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。当使用通用引物测序时，如果刚好和样品中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形。
2、测序出现双峰（套峰）要根据具体情况来判断可能造成原因，1）是单个碱基 ... [阅读全文 ]
2008-09-19
·PCR产物为什么要克隆测序 测序实验技术 ]
问：PCR产物为什么要克隆测序？
答：应该是确认一下，你所扩的条带是不是你想要的序列！
答：因为PCR扩增中可能会有错配。
答：测序反应开始和结束的一些序列不够准确，所以最好将待测序克隆到载体上测序。另外用载体测效率较高，应为模扳量大，纯度高。 ... [阅读全文 ]
2008-09-19
·菌液测序 测序实验技术 ]
问：前两天测序，送的菌液，800的反应，公司说测序不好，我看了一下测序峰图，信号衰减，信号越来越弱，到500BP以后就基本没有什么信号了，以前没有遇见这种情况，现在急着继续做实验，也没办法进行，希望大家帮忙，有什么解决的办法没？
答：测序公司有时候是侧不出来，他们回答大部分是信号弱或没有信号，不过没有关系的，他们不收费。解决的问题方法有：
1、换公司再测；
2、换一个克隆菌送测序。
答：检查一下 ... [阅读全文 ]
2008-09-19
·Target enrichment technologies for ABI SOLiD? 测序实验技术 ]
Q:my group is involved in a national project to develop a genomic platform for cancer research. while Nimblegen has developed target enrichment chip for the Genome Sequencer 20 nothing similar has bee ... [阅读全文 ]
2008-09-19
·SOLiD quality data 测序实验技术 ]
Q:We recently completed a ChIP-seq run on the ABI SOLiD. We received the following data back for one of our samples. These data were from a quarter (1/4) of a slide.
------------------61993194 total b ... [阅读全文 ]
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