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2008-09-01
·细胞转染 前沿科技及其它 ]
丁香园网友fxlys412：
我是刚刚开始接触实验的，对很多东西我都不太懂。所以想请教下各位达人。
我的问题是：要将一外源性基因转染PC3细胞，然后观察抗肿瘤药物对细胞的凋亡影响。
我现在不知道如何下手，是用腺病毒转染还是脂质体呢？该如何选择？
丁香园网友jollyyyhan认为：
两个都可以啊，我经常用的是脂质体，效率还是蛮高的。不过据说瞬时表达效率高，稳转的好像病毒载体要好筛选一点呢
丁香园网 ... [阅读全文 ]
2008-09-01
·转染后克隆筛选？ 前沿科技及其它 ]
问：
想请教各位：我在转染后要挑克隆，现在不知道该怎么做？我是在培养瓶中养细胞，现在用Ｇ４１８杀之后，克隆已经形成，且克隆间间距较大，如果要挑克隆该怎么做呢？谢谢！
答：
可以用滤纸片消化法对单个细胞岛进行消化。可以根据细胞岛的大小，裁滤纸片的大小。灭菌后使用。
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2008-09-01
·能否用elisa试剂盒检测细胞水平的蛋白 前沿科技及其它 ]
问：
能否用elisa试剂盒检测细胞水平的蛋白，用酶标仪检测么？或者用elisa试剂盒检测与细胞相关的一些指标，不是很清楚请举例！谢谢
答：
可以。比如说检测TGF-beta，是用酶标仪。方法：大鼠TGF-β1ELISA 试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中TGFβ1水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入TGFβ1抗原、生物素化 ... [阅读全文 ]
2008-09-01
·转染真核表达载体是否需要将载体线性化? 前沿科技及其它 ]
问：
我是新手，我想将一个构建的真核表达载体转染进HEK293细胞中，有人说要先将质粒线性化，也有人说不用，不知道到底应该怎样呢？如果需要线性化，具体怎么操作呢？谢谢了！
答：
要看你的目的，是做瞬时表达还是稳定表达，做稳定表达，为了更好的整合到细胞的基因组上，可将质粒线性化，选择好酶切位点。不酶切直接筛选稳定表达也可以得到结果。293转染效率还是较高的，一般不用稳定筛选。 ... [阅读全文 ]
2008-09-01
·有限稀释法 前沿科技及其它 ]
有限稀释法的程序
①制备饲养细胞悬液
②转染了重组质粒后的细胞计数，并调细胞数在1～5×10３/ml
③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液 ... [阅读全文 ]
2008-09-01
·原位杂交的难题 前沿科技及其它 ]
问：
各位好！我现在在大鼠脑组织的mRNA的原位杂交，测BDNF，DAB显色的时候有淡黄色，但是复染之后就是满视野蓝核了，只有零星的阳性结果，并且据文献报道以神经元阳性细胞多见，但是我是胶质细胞的阳性多于神经元，几乎神经元都没有阳性细胞。我用的是地高辛标记的寡核苷酸探针，是天津灏洋的，我的试验流程如下：1.二甲苯两次，10分钟每次，100%、90%、80%酒精各一次，每次10分钟。2.打孔液室温1 ... [阅读全文 ]
2008-09-01
·接毒后为什么没有病变 前沿科技及其它 ]
sjelly：我的CEF在接了马立克病毒后，一直没有病变出现，于是盲传了3代，还是没有病变，但是每一代提基因组还能P出病毒的条带来，而且很亮。我接了3批不同时间冻存的病毒，其中有两批是以前出过病变的，但是现在不知道为什么变这样了，是哪里出了问题啊？
丁香园网友bjzhaohong3认为：
不知楼主接种病毒病变时改变血清浓度没有，我们养细胞时血清是10%.而稀释接种病毒时血清浓度是2-3%.
sje ... [阅读全文 ]
2008-09-01
·挑细胞单克隆 前沿科技及其它 ]
wo4haoren：，小弟正在用G418筛选单克隆，用的是平皿，一个平皿长了大概几百个吧，但是怎么把单克隆消化，转板呢? 没有想到好的方法，想定点消化，发现胰酶会很快扩散，消化到其他克隆，很郁闷，有做过的大侠交流下经验，不胜感激！
丁香园网友cmingwen认为：
可以用枪头或者是无菌的东西把单克隆刮下来，再放在孔板培养，应该可以！
丁香园网友xinyinhancidian认为：
一般是用克隆环， ... [阅读全文 ]
2008-09-01
·细胞转染问题 前沿科技及其它 ]
转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型（对于困难的细胞系尤其如此），需要被转染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质），转染试剂等。但无论在何种情况下，转染的成功均取决于转染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要素。
细胞：
分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。同样重 ... [阅读全文 ]
2008-09-01
·lipofectamin 2000还是fugene HD好用 前沿科技及其它 ]
问：lipofectamin2000还是fugeneHD好用呢？大家一般倾向于用那个啊，我转染HEK293细胞，后要做细胞迁移和膜片钳。现在不知道选择那个转染试剂呢，谢谢！
答：
erenda认为：
以前实验室一直用的是lipofectamin2000，后来罗氏有换试用装，就试了一下。
感觉lipofectamin2000毒性比较大，对原代细胞的效果不好；FugeneHD比 ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·腺病毒转染神经元，转进去GFP的神经元全部死亡，什么原因？ 前沿科技及其它 ]
xunmixm问：
请教有经验的网友们，我利用重组后的腺病毒感染原代培养的小脑颗粒神经元，转染率在5%左右，但是发现凡是转染进去GFP的神经元全部死亡，（而转进GFP的杂质细胞－如胶质细胞状态良好），神经元表面好像桑葚状，感觉要碎掉了，有的漂起来，看不到有GFP标记的神经轴突。
请教如下问题：
1.造成上述神经元死亡的原因是什么呢？
2.如何提高腺病毒的转染率？可能我的病毒滴度还不够高。我的操作是 ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·脂质体2000用于细胞转染 前沿科技及其它 ]
因为脂质体2000的细胞毒性比较大，所以如果细胞比较敏感，可能要铺到90%左右，但是有些细胞如果铺板太密对细胞生长不利，或者有些只能长到40%-50%，那么建议考虑用毒性更低的转染试剂，象罗氏的Fugene HD ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·请问脂质体2000能转染Hela细胞吗 前沿科技及其它 ]
1.应该是可以的，但是脂质体2000的细胞毒性的确比较大，如果细胞比较敏感的话不建议使用。罗氏的FugeneHD细胞毒性比较小，而且效率也高，特别是对原代细胞，肿瘤细胞和干细胞。悬浮细胞的话还是电转吧。
2.可以，用脂质体2000转染Hela细胞，没感觉对Hela细胞毒性大，而且转染效果在70%以上。有过在转染过程中要注意边加入边摇晃液体，以免脂质体2000对局部细胞产生毒性作用。
... [阅读全文 ]
2008-08-31
·HepG2转染的相关问题 前沿科技及其它 ]
geniusma问：
准备做hepg2的转染试验了，实验室常用的的是lipofectamine 2000，听说hepG2的转染效率很低，并且这种细胞比较容易成团，这会影响转染效率吗？是否用trypsin+EDTA可以使其成为单个细胞不成团？哪种转染方法更适合hepg2?需要改用电转吗？如果用lipofectamine 2000，加入的比例如何?请有经验的朋友告知详细情况，谢谢！
丁香园网友star ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·腺病毒能在293中复制吗？ 前沿科技及其它 ]
腺病毒可以在293A细胞中进行转录，表达并可进行包装复制出大量高滴度病毒。293T是一种逆转录包装表达细胞，我做过也可进行表达，但还没有具体鉴定表达后的病毒是否可用。
293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒（Ad 5）DNA的永生化细胞，表达转染的腺病毒5的基因。
细胞来源都是人肧肾上皮细胞，293T细胞表达E1A蛋白，SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。293F ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·如何得到稳定转染的克隆 前沿科技及其它 ]
问：
各位园友，本人今天刚刚做了转染，用的24孔板，质粒是带有荧光的（含neo基因的载体），如果转进去了，下一步就要进行筛选？但是不知道具体该怎么做才能得到稳定转染的细胞？
答：
最好先做以下预实验，摸一下G418的浓度范围，以未转染的细胞做对照，当未转染细胞完全杀死作为最佳筛选浓度。在选择压力下待存活的细胞逐渐形成小克隆后可以传代，随后可以逐步降低G418浓度至原使用浓度的一半作为维持压力。这样 ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·细胞转染后抗生素选择 前沿科技及其它 ]
zhangcy2004问：
细胞转染后建立稳转细胞系大多用G418来杀，可是这种抗生素的选择是根据什么来确定的呢？还可以用其他的抗生素吗？
如果一个载体上有两个抗生素基因，氨苄青霉素和新霉素，那么建立稳转细胞系时该用哪种抗生素来杀细胞呢？刚结束这方面的知识，不甚了解，恳请高手指点迷津！非常感谢！
丁香园网友alfredyu2004认为：
虽然我也是不是太清楚，但是应该看转染是细菌还是细胞
氨苄青霉 ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·NADPH氧化酶检测方法的原理 前沿科技及其它 ]
Principle and method：
NADPH-dependent O，- generation was measured using the tetrazolium dye NBT as an electron acceptor.NBT is rapidly converted to monoformazan by two molecules of 02-.This reduction ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·RT-PCR中内参的作用？如何选择？ 前沿科技及其它 ]
内参是看家基因.我们一般用bate-actin，有时也用GAPDH
它的作用在于你提取的RNA逆转录成cDNA时，加入的浓度可能会不一致，即使用分光广度计测其浓度，也会有仪器误差.PCR时，每个标本都要做对应的内参，而且每次都要做，跑出的条带进行灰度分析，用目的基因的积分光密度比上内参的光密度就是你这个基因实际表达的量.
内参的选择，普通PCR内参的大小没有多大要求，但real time一般选择3 ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·用LIPO2000转染HepG2细胞的问题 前沿科技及其它 ]
乡乡问：
最近本人在做HepG2细胞的转染，转染的是GFP质粒，按照LIPO2000的说明书使用后，发现细胞的死亡很严重，24h时差不多死了一半。而且我在转染前细胞密度差不多达到90%，也在转染后6小时的时候换了培养基。在显微镜下看荧光的转染效率大概有70%－80%，虽然效率还可以，但是由于细胞死亡对我后续的实验有影响，所以在此请教各位高手，如何才能使细胞不死，或有说明实验室对于HepG2的转染有 ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·如何提高U251的转染效率 前沿科技及其它 ]
问：
手上有U251细胞，pEGFP载体，现在将不带外源基因的载体转u251的效率都很低，10%都没有。
所用转染试剂：invitrogen的Lipofectamine 2000和威格拉斯的Vigofect，效率都很低，试过不同细胞密度，不同的DNA和转染试剂的比值，还是不行。
各位高人有没有什么建议，另外转染的时候使用有血清的培养基养细胞，不知道影响大不大（说明书上说没有影响），稀释DNA和转染 ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·细胞要做基因沉默相关实验，培养基可以加双抗吗 前沿科技及其它 ]
华之风问：
请教园里战友，本人拟用siRNA转染做平滑肌细胞，观察基因沉默后效果的，但是我们实验室环境不太好，细胞培养容易污染，想加双抗，但不知道加双抗对基因转染沉默有无影响，谢谢！
丁香园网友hainblue认为：
有影响的，以前用脂质体转染的时候，说明书上说的是转染时不要用含有抗生素的培养基。他的解释是可能引起细胞死亡。具体怎么样就不知道了，比较试剂很贵，没钱作者方面的尝试。
丁香园网友lau ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·g418如何配制 前沿科技及其它 ]
问：
最近要做稳定转染了，但不知道如何配制G418，有一些细节想问问大家，我打算用PBS来配，我想问问是用高压过的PBS来配，还是用未高压的PBS配，配完了是不是要过滤，然后放到-20保存，用的时候是不是放在4度.请各位来帮我解答一下，谢谢.
答：
我实验室的师兄一直是用HEPES配制的，因为PBS对细胞的损伤会大一些。
配的时候就是用配好的HEPES溶G418，然后过滤，不用高压灭菌了，配好后分 ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·免疫磁珠分选的问题 前沿科技及其它 ]
问：
现用免疫磁珠（美天妮）分选cd4＋和cd8＋T淋巴细胞，效果不是太理想。单个核细胞2×106，分离出cd4＋只有1×105个，buffer等试剂都没有问题。不知道还有什么地方没有注意到，希望各位战友指点？
答：
呵呵，我也用美天妮分离CD14+单核细胞，结果还不错。
分出的细胞占单个核细胞五分之一。
我是根据说明书进行操作的，觉得以下几方面比较重要：
（1） ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·苏木素染料的配制 前沿科技及其它 ]
问：
配制苏木素染料所用的氧化汞一般用白氧化汞还是黄氧化汞？
答：
苏木红的产生需经氧化才能获得，获得苏木红有两种方法，其中一种是加入黄色氧化汞促进成熟，期间的注意事项：
①苏木素一定要预先溶解，否则较难彻底溶解。
②加入黄色氧化汞后，可产生大量的气泡，因此，配制500ml的溶液，一定要选择2000ml以上的容器，否则液体便会溢出。
③当溶液变为深紫色后，应终止氧化，烧瓶应直接插入冰水中，
&nb ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·稳转用什么型号的脂质体 前沿科技及其它 ]
问：
我现在用做逆转录病毒包装，先要建立包装细胞，想问大家一下，Invitrogen公司有两种脂质体，Lipofectamine 2000和lipofectin，要进行稳转的话，是用哪一种啊，见有人说Lipofectamine 2000用于瞬时转染效率最高，lipofectin主要用于Stable transfection，不知道对不对啊？
同时做稳转的质粒有什么要求啊？必须是用无内毒素的吗？
答 ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·Ba/f3细胞的培养，wehi细胞如何作为其IL-3来源？ 前沿科技及其它 ]
问：
我需要将病毒转到BA/F3细胞中，但此细胞养起来很复杂，查到文献加入15% WEHI-3B conditioned medium as the source of IL-3，园子里搜索到DXY721的帖子，遗憾的是没有积分，看不到积分限制帖，但我又急需了解wehi细胞的上清可否由简单的保存方式，比如可否一周滤它几次，在四度或-20保存，然后，用多少加多少，还是必须现用现滤等资料？
答：
首先 ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·需要注射至小鼠体内的细胞用那种转染方法最好 前沿科技及其它 ]
xuliang问：我现在做的课题需要向细胞中转染Foxp3基因，然后把转染后的细胞注射至小鼠体内。看介绍说脂质体有毒性，会引起小鼠发生肺炎。我是刚开始接触转染，对转染还不熟悉。请教各位高手，象我这种情况最好使用哪种转染方法，转染后的细胞注射至体内后对小鼠的毒性最小。万分感谢！
丁香园网友ggppllzzww认为：
脂质体对小鼠有毒性，细胞并没有。
直接把转染过脂质体的细胞，通过小鼠尾静脉打进去就可 ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·免疫共沉淀 前沿科技及其它 ]
简单的步骤！
Co-IP：
1.resuspend pellets in 100µl EBC-buffer
2.take 20µl for Input control，+ 7µl put at -20℃4x sample buffer and boil 6min at 100℃
3.add 400µl EBC-buffer and incubat ... [阅读全文 ]
2008-08-31
·cos-7的转染 前沿科技及其它 ]
问：cos-7的转染
1、细胞的培养：我们在培养细胞时发现该细胞长的很快，不到2天的时间就长满了；消化的时候老是成块的掉，如果消化时间加长，细胞也能成单个的，但是细胞的生长力又减弱了，请问要怎样来克服这一问题呢？
2、转染前：转染前16-24h我们用含血清不含抗生素的MEM传进6孔盘，16h左右就发现细胞贴壁了，但是形态没有以前好，并且漂死细胞相当多。最初我们都以为是细胞没有贴壁，又把细胞放进培养 ... [阅读全文 ]
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