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| 2008-09-10 |
·培养基配制 - [培养基] |
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丁香园网友yflfen的问题为：
1. 配制培养基时碳酸氢钠和hepes添加量之间有没有什么必然的联系？我已经的做法对培养基的质量有没有影响，影响有多大？我可否按DMEM的说明书添加3.7g/L的碳酸氢钠，此外再自己再另行添加20mM的hepes。
我参考其他文献上的做法时，就有疑问，但后来还是“根据文献介绍（但文献中用的是Hyclone的DMEM）只添加了1.97g/L的碳酸氢钠，同 ... [阅读全文]
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| 2008-09-10 |
·PC12细胞培养及实验设计 - [原代培养] |
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PC12是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系属神经嵴源性具有神经细胞特性.
由于具有分化型和未分化型两种形式因此很多朋友包括我本人在内都困惑过做实验时应该选择哪种类型?
根据最近查到的资料发现无论分化型还是未分化型都可以作为神经细胞来使用分化型的PC12可以看待为成熟的神经元因为无论形态还是生化特征都与神经细胞类似.而未分化型PC12可以看待为未成熟的神经元.
值得注意的一个问题是关于PC12培养液的使用 ... [阅读全文]
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| 2008-09-10 |
·细胞冷冻保存方法、注意事项 - [冻存与复苏] |
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1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 – 90 ％致密度。
2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
3、注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650 ... [阅读全文]
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| 2008-09-10 |
·Transwell侵袭实验总结 - [前沿科技及其它] |
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第一节 概念
这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。
1.Transwell
关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器 ... [阅读全文]
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| 2008-09-10 |
·原代培养海马神经元经验 - [原代培养] |
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一、常规的试剂配制：
1、培养基：选用高糖型DMEM/F12 (1:1)培养基干粉（含15 mmol Hepes），每升培养液中加入碳酸氢钠1.8 g，调节pH值7.0，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，加入谷氨酰胺、无菌的青霉素和链霉素液，使其终浓度分别为0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分装后置于4℃保存，临用前加入2%的B27。神经细胞代谢旺盛，选 ... [阅读全文]
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| 2008-09-10 |
·细胞培养液讨论 - [培养基] |
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细胞培养基
培养基是既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。
（1）合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。 ... [阅读全文]
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| 2008-09-04 |
·L929培养过程中的异常形态问题 - [细胞形态检测] |
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问：复苏后的L929培养第三天出现如图所示的情况，细胞形态不好，而且看上去细胞底层有层模糊的东西，电镜下观察有成块的黑点出现。是什么原因呢？另：培养液偏碱。
看上去细胞处于亚健康状态：
1、可能由于培养瓶不干净，而造成细胞底层模糊，而造成的污染；
2、成块的黑点出现可能由于刚复苏出来的细胞部分死亡而聚集成的死细胞团；
3、可能由于细胞在冻存时或是复苏时发生了污染，例如培养基的污染，胰酶的污染，传代 ... [阅读全文]
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| 2008-09-04 |
·细胞周期 - [细胞百科] |
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测定细胞DNA含量有二个理由说明用流式细胞术测定细胞脱氧核糖核酸(DNA)含量是有效的研究手段。首先，对每个细胞的DNA含量进行定量可告诉我们该细胞是否正常。其次，对处于细胞分裂周期各不同阶段的细胞比例进行分析可告诉我们细胞的分裂速度，这是对细胞功能状态的较好评估指标之一。以往常用间接方法测定细胞DNA含量，即测定与DNA呈化学计量学结合的染料的荧光强度。
加用第二个参数可使DNA分析获得更多信息 ... [阅读全文]
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| 2008-09-04 |
·细胞培养污染的思考 - [污染及防治] |
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污染是细胞培养技术中面临的主要问题。由每一种细胞有其独特的培养体系，因此污染造成后果也不尽相同。某些污染的发生往往难以察觉检测，而且污染源能长期共存于培养体系中，这类染事实上大部分被人们忽视了。培养的细胞作为个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作相应的反应，造成培养细胞生物学特性的改变，而实验结果造成潜在的威胁，而且随着污染时间的长而增加。培养环境中的物理、化学及生物因素都可能入培养环境造成污 ... [阅读全文]
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| 2008-09-04 |
·动物细胞的大规模培养技术 - [原代培养] |
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大规模培养哺乳类细胞是生产许多临床和医学上重要生物制品的一种有效的方法，这些生物制品包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单克隆抗体等，推动了生物学和医学的发展，给医学卫生事业带来了巨大的社会效益和经济效益。基因工程技术、细胞工程技术，以及新的细胞大规模繁殖培养系统的发展，是构成上述成就的主要原因。然而，体外大规模繁殖真核细胞要比原核细胞困难得多，如细菌、酵母菌和霉菌的细胞壁厚，能耐受搅拌，不易破碎， ... [阅读全文]
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| 2008-09-04 |
·培养基手册 - [培养基] |
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一、培养基的历史
体外培养（in vitro culture）包括：组织培养（tissue culture）、细胞培养（cell culture）、器官培养（organ culture）。顾名思义，就是将活体结构成分（如活体组织、活体细胞或者活体器官等）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的方法。广义组织培养与体外培养同义。
体外培养已经历了约一百年的发展历史， ... [阅读全文]
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| 2008-09-04 |
·细胞培养常见问题及其解决 - [培养基] |
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1、如何选用特殊细胞系培养基？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。
2、何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用 ... [阅读全文]
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| 2008-09-04 |
·细胞培养从头学 - [培养基] |
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常用设备
准备室的设备：
单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：
液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在 ... [阅读全文]
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| 2008-09-04 |
·无菌操作基本技术 - [培养基] |
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无菌操作基本技术
1、实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70%ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作 ... [阅读全文]
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| 2008-09-04 |
·细胞培养经验 - [原代培养] |
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培养基
1、关于培养基，如果不是买液体的，那么其ph问题一定要给予充分重视！配置过程中的调解我就不说了，能用ph计最好！
2、关于培养基的保存，如果你有输液瓶，那么我建议你每一次打开以后，最好还是换一个胶塞。如果象我一样就是普通培养瓶，那么记得一定要用封口膜封口，不要担心封口膜会带来更多的污染！你可以先将封口膜在使用前开紫外时略微照一下！但是保存封口膜最好找一个密封的瓶子等，比如吃完糖的罐子。
3 ... [阅读全文]
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| 2008-09-04 |
·细胞破碎的方法 - [细胞成分提取] |
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问：我要分离细胞器，先要破碎细胞。查文章是用Polytron匀浆器或Dounce匀浆器或者Potter-Elvehjem匀浆器。请问它们有什么区别吗？价格是多少呢？细胞破碎能用玻璃的普通匀浆器代替吗？
答：不同的细胞器分离的方法是不同的，因此随之而然的破碎细胞的方法也是有差异的。具体如下：
一、细胞器的分离：制备某种生物大分子时，往往需要采用细胞中某一部分为材料；或者为了纯化某一特定细胞器上的生物 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·癌细胞的分离培养和接种 - [原代培养] |
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问：我手上现有冻存的小鼠c26结肠癌和lewis肺癌组织块，请问怎样把癌细胞分离出来培养，然后接种到小鼠身上？
答：方法：
1、组织块——酒精浸泡——剪碎——Hank's冲洗——胰酶消化——离心——Hank's冲洗——离心&mdas ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·逆转录病毒包装 - [前沿科技及其它] |
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问：
大家好，请问有人做过逆转录病毒包装吗，我最近在用PT67包装病毒，按照说明书上的要求，在细胞长到70%左右汇合时加入质粒和脂质体和无血清培养液培养4小时后更换为完全培养基继续培养24小时后加300μg/MLG418筛选，现在加药已经36个小时了，可是看细胞长的密密麻麻的大概有100%了吧，还不见细胞往下掉，我真是急死了，300μg/ml的筛选浓度是我在预实验里确定的应该错不了，可 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·转染细胞的问题 - [前沿科技及其它] |
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问：我想问个问题关于转染细胞的质粒，必须用试剂盒提取的么？用碱裂解法可以么？抽提两次浓缩一次，测得浓度是8点多，ratio是1.814，可以送去转染细胞不？人的细胞系。
答：碱裂解法比试剂盒提取的纯度要低，但是浓度高。其实，剂盒提取的原理和碱裂解法的一样，只不过最后过个吸附柱和蛋白洗脱，从而纯度较好。碱裂解法提取可以用来转染。几年前我还没用盒子时都是用碱裂解法提取转染，效果ok。 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·请教 luciferase 的 具体操作PROTOCOL - [前沿科技及其它] |
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问：我要做LUCIFERASE 了，可是我一点概念都没有。有哪位有具体的操作PROTOCOL？
还有一些白痴问题luciferase 要检测什么呢？是把我的带有LUC的质粒转染到细胞里，然后检测它的活性？什么意思啊？
我检测它的目的是什么呢？我只知道我现在有一个LUC的质粒，老板让我准备做，我都不知道是什么目的和思路......
谢谢啦
答：
luciferase检测的是虫荧光素酶基因的表达情况， ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·悬浮细胞转染后筛选问题求助 - [前沿科技及其它] |
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问：
大家好，我第一次作转染，是悬浮细胞，
已经在园子里看了好多这方面的资料，收获很大，可还是几个问题要问大家：
1）我打算用24孔板作转染，之后的筛选过程中肯定会有很多死细胞。这样小的体积（500μl），能不能作低速离心去死细胞呢？如果不能，要怎么去除死细胞呢？
2）在96孔板每孔1个细胞的筛选的过程中，大家一般种多少孔进行筛选呢？
3）96孔板筛选过程中，每个孔体积那么小要不要换液呢？需 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·同一种细胞，不同质粒转染，那G418筛选浓度都一样吗 - [前沿科技及其它] |
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问：跟文献上的细胞一样，但跟他的质粒不一样，文献上说G418筛选浓度为500mg/ml，那我可以直接用这个浓度筛选我转染以后的浓度吗？质粒的不同对同一细胞的G418筛选浓度影响大吗？
答：
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。尽管文献上说特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的，但是由于实验 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·做稳定转染选择何种质粒提取试剂盒 - [前沿科技及其它] |
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问：我想用纸脂体转染法将质粒稳定转染入肿瘤细胞，请问可以选择哪种试剂盒？ 因为我不报销费用，所以想选一种即好用又较为便宜的，请求指点。谢谢
答：您的情况我们去年也曾遇到过。目前市面上的质粒提取试剂盒林林总总，令人难以取舍。我觉得首先应该根据自己的需要来选取。进口的试剂盒，比如qiagene，omiga，promega等固然好，但是价格较贵，如果自己的实验要求不是很高的话，用这些试剂盒感觉有浪费的嫌 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·如何提高转染率 - [前沿科技及其它] |
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oldhappy求助：我做的是脂质体法转染（lipfectermine 2000）骨髓间充质干细胞（c57小鼠），现在刚转的是第3代细胞，铺板都很好，细胞密度也很大，但是36-48h观察基本没有荧光，也应该是没有转上了，宁外我的重组质粒时间很长了，提取有2个多月了，是不是这也有很大关系，以前的转染还算成功的/转染量如下。
A2.0重组质粒+50 培养基 B1.5脂质体+50 培养基
... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·萤光素酶载体PGL3转染细胞要不要加G418 - [前沿科技及其它] |
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问：最近要做萤光素酶载体PGL3转染细胞，PGL3载体上面带有neo的抗性标记，有一个老师和我说要培养基里面要加G418筛选，但我查了一些PGL3载体转染的文献，都没有提到加G418，所以想问问学长们到底要不要加G418？
答：Neo是一个抗性基因，pGL3系列的载体上有这个抗性基因；Neo在原核（大肠杆菌）中表达的是Kan抗性；在真菌（链霉）中表达的是新霉素抗性；而在真核（细胞、酵母）中表达的则 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·细胞接种密度 - [前沿科技及其它] |
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问：最近的一个实验困扰我许久，就是关于给药剂量的问题，具体如下： 我在培养瓶中按1*10E6密度观察了心肌细胞的搏动和药物的干预情况，接下来想做MTT，需要用96孔板做，是否还需要保持原来的密度，或可以降到5*10E5呢，希望高手指点，
答：1.给药剂量需要预实验摸索，可以用6孔或24孔板实验，按照倍比或10倍浓度梯度设计不同剂量组，观察药物量效关系，最终再选择合适的浓度或更合理的浓度梯度进行下一 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·NIH3T3 TK-是什么意思 - [前沿科技及其它] |
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NIH3T3细胞中本身是没有TK的，1981年Scolnick利用lambda载体把胸腺嘧啶激酶（TK）转入NIH3T3细胞，构建成NIH3T3 TK细胞，所以细胞分为NIH3T3 TK＋和NIH3T3 TK-两种细胞，在Scolnick认为NIH3T3就是NIH3T3（TK－）。
他做转染细胞的基础是基于1969年Todaro的实验。
具体内容参看建株文献：J Virol.1981 Septem ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·稳定转染细胞株的鉴定 - [前沿科技及其它] |
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问：目的蛋白7kd，筛了稳定株，可western检测不到，因为电泳时marker也跑得不好，因此不能确定是假阳性。
载体上带了myc tag，不知做免疫荧光来检测是否可行？谢谢
答：原理上可行。如果免疫荧光对你来说比wb更熟练的话，你可以选择用荧光来检测。反之，还是用wb检测，再把实验尽量做得好一些。用wb的话，可以用你target蛋白的特异性抗体，也可以用anti-myc的抗体，最好两者都做了， ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·质体转染293细胞后,细胞漂浮死亡？ - [前沿科技及其它] |
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问：
这几天做293细胞的脂质体转染，为腺病毒的包装阶段.
用最小的培养瓶（好像是25ml的），加入脂质体10μl，pacI酶切纯化物8μg 进行转染.细胞最密处为80-90%，大部分为60%左右.
48小时后，1/3的细胞漂起来，但有荧光出现.4天后漂起来一半，最密处的视野见20个左右的荧光.以前细胞相对稀疏的地方，仅有很少的细胞还附壁，完全无法见到荧光，即除开原先细胞较密的一小处外 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·转染细胞全死了的原因 - [前沿科技及其它] |
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问：
构建逆转录病毒为载体的DNA（质粒），阳离子脂质体2000（过期的），转染病毒包装细胞pt67，G418筛选，在换液和传代过程中均会有细胞死亡（贴壁细胞漂浮）。求教原因。
换液3.6ml DMEM+0.4ml新生牛血清+24μlG418
传代用胰酶ph 7.2，1ml，用0.3ml新生牛血清中和，800rpm离心5min，弃上清，加入上述培养液。
答：
做一下G418浓度筛选，另外你的 ... [阅读全文]
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