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| 2008-09-10 |
·Transwell侵袭实验总结 - [前沿科技及其它] |
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第一节 概念
这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。
1.Transwell
关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·逆转录病毒包装 - [前沿科技及其它] |
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问：
大家好，请问有人做过逆转录病毒包装吗，我最近在用PT67包装病毒，按照说明书上的要求，在细胞长到70%左右汇合时加入质粒和脂质体和无血清培养液培养4小时后更换为完全培养基继续培养24小时后加300μg/MLG418筛选，现在加药已经36个小时了，可是看细胞长的密密麻麻的大概有100%了吧，还不见细胞往下掉，我真是急死了，300μg/ml的筛选浓度是我在预实验里确定的应该错不了，可 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·转染细胞的问题 - [前沿科技及其它] |
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问：我想问个问题关于转染细胞的质粒，必须用试剂盒提取的么？用碱裂解法可以么？抽提两次浓缩一次，测得浓度是8点多，ratio是1.814，可以送去转染细胞不？人的细胞系。
答：碱裂解法比试剂盒提取的纯度要低，但是浓度高。其实，剂盒提取的原理和碱裂解法的一样，只不过最后过个吸附柱和蛋白洗脱，从而纯度较好。碱裂解法提取可以用来转染。几年前我还没用盒子时都是用碱裂解法提取转染，效果ok。 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·请教 luciferase 的 具体操作PROTOCOL - [前沿科技及其它] |
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问：我要做LUCIFERASE 了，可是我一点概念都没有。有哪位有具体的操作PROTOCOL？
还有一些白痴问题luciferase 要检测什么呢？是把我的带有LUC的质粒转染到细胞里，然后检测它的活性？什么意思啊？
我检测它的目的是什么呢？我只知道我现在有一个LUC的质粒，老板让我准备做，我都不知道是什么目的和思路......
谢谢啦
答：
luciferase检测的是虫荧光素酶基因的表达情况， ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·悬浮细胞转染后筛选问题求助 - [前沿科技及其它] |
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问：
大家好，我第一次作转染，是悬浮细胞，
已经在园子里看了好多这方面的资料，收获很大，可还是几个问题要问大家：
1）我打算用24孔板作转染，之后的筛选过程中肯定会有很多死细胞。这样小的体积（500μl），能不能作低速离心去死细胞呢？如果不能，要怎么去除死细胞呢？
2）在96孔板每孔1个细胞的筛选的过程中，大家一般种多少孔进行筛选呢？
3）96孔板筛选过程中，每个孔体积那么小要不要换液呢？需 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·同一种细胞，不同质粒转染，那G418筛选浓度都一样吗 - [前沿科技及其它] |
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问：跟文献上的细胞一样，但跟他的质粒不一样，文献上说G418筛选浓度为500mg/ml，那我可以直接用这个浓度筛选我转染以后的浓度吗？质粒的不同对同一细胞的G418筛选浓度影响大吗？
答：
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。尽管文献上说特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的，但是由于实验 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·做稳定转染选择何种质粒提取试剂盒 - [前沿科技及其它] |
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问：我想用纸脂体转染法将质粒稳定转染入肿瘤细胞，请问可以选择哪种试剂盒？ 因为我不报销费用，所以想选一种即好用又较为便宜的，请求指点。谢谢
答：您的情况我们去年也曾遇到过。目前市面上的质粒提取试剂盒林林总总，令人难以取舍。我觉得首先应该根据自己的需要来选取。进口的试剂盒，比如qiagene，omiga，promega等固然好，但是价格较贵，如果自己的实验要求不是很高的话，用这些试剂盒感觉有浪费的嫌 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·如何提高转染率 - [前沿科技及其它] |
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oldhappy求助：我做的是脂质体法转染（lipfectermine 2000）骨髓间充质干细胞（c57小鼠），现在刚转的是第3代细胞，铺板都很好，细胞密度也很大，但是36-48h观察基本没有荧光，也应该是没有转上了，宁外我的重组质粒时间很长了，提取有2个多月了，是不是这也有很大关系，以前的转染还算成功的/转染量如下。
A2.0重组质粒+50 培养基 B1.5脂质体+50 培养基
... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·萤光素酶载体PGL3转染细胞要不要加G418 - [前沿科技及其它] |
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问：最近要做萤光素酶载体PGL3转染细胞，PGL3载体上面带有neo的抗性标记，有一个老师和我说要培养基里面要加G418筛选，但我查了一些PGL3载体转染的文献，都没有提到加G418，所以想问问学长们到底要不要加G418？
答：Neo是一个抗性基因，pGL3系列的载体上有这个抗性基因；Neo在原核（大肠杆菌）中表达的是Kan抗性；在真菌（链霉）中表达的是新霉素抗性；而在真核（细胞、酵母）中表达的则 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·细胞接种密度 - [前沿科技及其它] |
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问：最近的一个实验困扰我许久，就是关于给药剂量的问题，具体如下： 我在培养瓶中按1*10E6密度观察了心肌细胞的搏动和药物的干预情况，接下来想做MTT，需要用96孔板做，是否还需要保持原来的密度，或可以降到5*10E5呢，希望高手指点，
答：1.给药剂量需要预实验摸索，可以用6孔或24孔板实验，按照倍比或10倍浓度梯度设计不同剂量组，观察药物量效关系，最终再选择合适的浓度或更合理的浓度梯度进行下一 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·NIH3T3 TK-是什么意思 - [前沿科技及其它] |
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NIH3T3细胞中本身是没有TK的，1981年Scolnick利用lambda载体把胸腺嘧啶激酶（TK）转入NIH3T3细胞，构建成NIH3T3 TK细胞，所以细胞分为NIH3T3 TK＋和NIH3T3 TK-两种细胞，在Scolnick认为NIH3T3就是NIH3T3（TK－）。
他做转染细胞的基础是基于1969年Todaro的实验。
具体内容参看建株文献：J Virol.1981 Septem ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·稳定转染细胞株的鉴定 - [前沿科技及其它] |
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问：目的蛋白7kd，筛了稳定株，可western检测不到，因为电泳时marker也跑得不好，因此不能确定是假阳性。
载体上带了myc tag，不知做免疫荧光来检测是否可行？谢谢
答：原理上可行。如果免疫荧光对你来说比wb更熟练的话，你可以选择用荧光来检测。反之，还是用wb检测，再把实验尽量做得好一些。用wb的话，可以用你target蛋白的特异性抗体，也可以用anti-myc的抗体，最好两者都做了， ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·质体转染293细胞后,细胞漂浮死亡？ - [前沿科技及其它] |
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问：
这几天做293细胞的脂质体转染，为腺病毒的包装阶段.
用最小的培养瓶（好像是25ml的），加入脂质体10μl，pacI酶切纯化物8μg 进行转染.细胞最密处为80-90%，大部分为60%左右.
48小时后，1/3的细胞漂起来，但有荧光出现.4天后漂起来一半，最密处的视野见20个左右的荧光.以前细胞相对稀疏的地方，仅有很少的细胞还附壁，完全无法见到荧光，即除开原先细胞较密的一小处外 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·转染细胞全死了的原因 - [前沿科技及其它] |
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问：
构建逆转录病毒为载体的DNA（质粒），阳离子脂质体2000（过期的），转染病毒包装细胞pt67，G418筛选，在换液和传代过程中均会有细胞死亡（贴壁细胞漂浮）。求教原因。
换液3.6ml DMEM+0.4ml新生牛血清+24μlG418
传代用胰酶ph 7.2，1ml，用0.3ml新生牛血清中和，800rpm离心5min，弃上清，加入上述培养液。
答：
做一下G418浓度筛选，另外你的 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·细胞转染 - [前沿科技及其它] |
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丁香园网友fxlys412：
我是刚刚开始接触实验的，对很多东西我都不太懂。所以想请教下各位达人。
我的问题是：要将一外源性基因转染PC3细胞，然后观察抗肿瘤药物对细胞的凋亡影响。
我现在不知道如何下手，是用腺病毒转染还是脂质体呢？该如何选择？
丁香园网友jollyyyhan认为：
两个都可以啊，我经常用的是脂质体，效率还是蛮高的。不过据说瞬时表达效率高，稳转的好像病毒载体要好筛选一点呢
丁香园网 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·转染后克隆筛选？ - [前沿科技及其它] |
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问：
想请教各位：我在转染后要挑克隆，现在不知道该怎么做？我是在培养瓶中养细胞，现在用Ｇ４１８杀之后，克隆已经形成，且克隆间间距较大，如果要挑克隆该怎么做呢？谢谢！
答：
可以用滤纸片消化法对单个细胞岛进行消化。可以根据细胞岛的大小，裁滤纸片的大小。灭菌后使用。
... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·能否用elisa试剂盒检测细胞水平的蛋白 - [前沿科技及其它] |
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问：
能否用elisa试剂盒检测细胞水平的蛋白，用酶标仪检测么？或者用elisa试剂盒检测与细胞相关的一些指标，不是很清楚请举例！谢谢
答：
可以。比如说检测TGF-beta，是用酶标仪。方法：大鼠TGF-β1ELISA 试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中TGFβ1水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入TGFβ1抗原、生物素化 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·转染真核表达载体是否需要将载体线性化? - [前沿科技及其它] |
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问：
我是新手，我想将一个构建的真核表达载体转染进HEK293细胞中，有人说要先将质粒线性化，也有人说不用，不知道到底应该怎样呢？如果需要线性化，具体怎么操作呢？谢谢了！
答：
要看你的目的，是做瞬时表达还是稳定表达，做稳定表达，为了更好的整合到细胞的基因组上，可将质粒线性化，选择好酶切位点。不酶切直接筛选稳定表达也可以得到结果。293转染效率还是较高的，一般不用稳定筛选。 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·有限稀释法 - [前沿科技及其它] |
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有限稀释法的程序
①制备饲养细胞悬液
②转染了重组质粒后的细胞计数，并调细胞数在1～5×10３/ml
③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·原位杂交的难题 - [前沿科技及其它] |
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问：
各位好！我现在在大鼠脑组织的mRNA的原位杂交，测BDNF，DAB显色的时候有淡黄色，但是复染之后就是满视野蓝核了，只有零星的阳性结果，并且据文献报道以神经元阳性细胞多见，但是我是胶质细胞的阳性多于神经元，几乎神经元都没有阳性细胞。我用的是地高辛标记的寡核苷酸探针，是天津灏洋的，我的试验流程如下：1.二甲苯两次，10分钟每次，100%、90%、80%酒精各一次，每次10分钟。2.打孔液室温1 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·接毒后为什么没有病变 - [前沿科技及其它] |
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sjelly：我的CEF在接了马立克病毒后，一直没有病变出现，于是盲传了3代，还是没有病变，但是每一代提基因组还能P出病毒的条带来，而且很亮。我接了3批不同时间冻存的病毒，其中有两批是以前出过病变的，但是现在不知道为什么变这样了，是哪里出了问题啊？
丁香园网友bjzhaohong3认为：
不知楼主接种病毒病变时改变血清浓度没有，我们养细胞时血清是10%.而稀释接种病毒时血清浓度是2-3%.
sje ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·挑细胞单克隆 - [前沿科技及其它] |
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wo4haoren：，小弟正在用G418筛选单克隆，用的是平皿，一个平皿长了大概几百个吧，但是怎么把单克隆消化，转板呢? 没有想到好的方法，想定点消化，发现胰酶会很快扩散，消化到其他克隆，很郁闷，有做过的大侠交流下经验，不胜感激！
丁香园网友cmingwen认为：
可以用枪头或者是无菌的东西把单克隆刮下来，再放在孔板培养，应该可以！
丁香园网友xinyinhancidian认为：
一般是用克隆环， ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·细胞转染问题 - [前沿科技及其它] |
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转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型（对于困难的细胞系尤其如此），需要被转染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质），转染试剂等。但无论在何种情况下，转染的成功均取决于转染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要素。
细胞：
分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。同样重 ... [阅读全文]
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| 2008-09-01 |
·lipofectamin 2000还是fugene HD好用 - [前沿科技及其它] |
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问：lipofectamin2000还是fugeneHD好用呢？大家一般倾向于用那个啊，我转染HEK293细胞，后要做细胞迁移和膜片钳。现在不知道选择那个转染试剂呢，谢谢！
答：
erenda认为：
以前实验室一直用的是lipofectamin2000，后来罗氏有换试用装，就试了一下。
感觉lipofectamin2000毒性比较大，对原代细胞的效果不好；FugeneHD比 ... [阅读全文]
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| 2008-08-31 |
·腺病毒转染神经元，转进去GFP的神经元全部死亡，什么原因？ - [前沿科技及其它] |
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xunmixm问：
请教有经验的网友们，我利用重组后的腺病毒感染原代培养的小脑颗粒神经元，转染率在5%左右，但是发现凡是转染进去GFP的神经元全部死亡，（而转进GFP的杂质细胞－如胶质细胞状态良好），神经元表面好像桑葚状，感觉要碎掉了，有的漂起来，看不到有GFP标记的神经轴突。
请教如下问题：
1.造成上述神经元死亡的原因是什么呢？
2.如何提高腺病毒的转染率？可能我的病毒滴度还不够高。我的操作是 ... [阅读全文]
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| 2008-08-31 |
·脂质体2000用于细胞转染 - [前沿科技及其它] |
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因为脂质体2000的细胞毒性比较大，所以如果细胞比较敏感，可能要铺到90%左右，但是有些细胞如果铺板太密对细胞生长不利，或者有些只能长到40%-50%，那么建议考虑用毒性更低的转染试剂，象罗氏的Fugene HD ... [阅读全文]
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| 2008-08-31 |
·请问脂质体2000能转染Hela细胞吗 - [前沿科技及其它] |
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1.应该是可以的，但是脂质体2000的细胞毒性的确比较大，如果细胞比较敏感的话不建议使用。罗氏的FugeneHD细胞毒性比较小，而且效率也高，特别是对原代细胞，肿瘤细胞和干细胞。悬浮细胞的话还是电转吧。
2.可以，用脂质体2000转染Hela细胞，没感觉对Hela细胞毒性大，而且转染效果在70%以上。有过在转染过程中要注意边加入边摇晃液体，以免脂质体2000对局部细胞产生毒性作用。
... [阅读全文]
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| 2008-08-31 |
·HepG2转染的相关问题 - [前沿科技及其它] |
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geniusma问：
准备做hepg2的转染试验了，实验室常用的的是lipofectamine 2000，听说hepG2的转染效率很低，并且这种细胞比较容易成团，这会影响转染效率吗？是否用trypsin+EDTA可以使其成为单个细胞不成团？哪种转染方法更适合hepg2?需要改用电转吗？如果用lipofectamine 2000，加入的比例如何?请有经验的朋友告知详细情况，谢谢！
丁香园网友star ... [阅读全文]
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| 2008-08-31 |
·腺病毒能在293中复制吗？ - [前沿科技及其它] |
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腺病毒可以在293A细胞中进行转录，表达并可进行包装复制出大量高滴度病毒。293T是一种逆转录包装表达细胞，我做过也可进行表达，但还没有具体鉴定表达后的病毒是否可用。
293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒（Ad 5）DNA的永生化细胞，表达转染的腺病毒5的基因。
细胞来源都是人肧肾上皮细胞，293T细胞表达E1A蛋白，SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。293F ... [阅读全文]
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| 2008-08-31 |
·如何得到稳定转染的克隆 - [前沿科技及其它] |
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问：
各位园友，本人今天刚刚做了转染，用的24孔板，质粒是带有荧光的（含neo基因的载体），如果转进去了，下一步就要进行筛选？但是不知道具体该怎么做才能得到稳定转染的细胞？
答：
最好先做以下预实验，摸一下G418的浓度范围，以未转染的细胞做对照，当未转染细胞完全杀死作为最佳筛选浓度。在选择压力下待存活的细胞逐渐形成小克隆后可以传代，随后可以逐步降低G418浓度至原使用浓度的一半作为维持压力。这样 ... [阅读全文]
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Copyright © 2008-2012