Nevin: 不知你用的是哪家公司的试剂盒，我也在用TUNEL 检测淍亡，而且很巧 我用的也是大鼠全脑石蜡切片（我是MCAO模型的），可能我比你幸运，我当时是一预试就成功的。针对你的步骤，我提一些意见，供你参考:
1、未知你脱蜡水化彻底否，我是这样的：Deparaffinize sections in 2 changes of xylene for 5 minutes each, and hydrate with 2 changes of 100% ethanol for 5 minutes each, and 90% ethanol for 5 minute, 80% ethanol for 5 minute, 70% ethanol for 5 minute.
2、蛋白酶K37度30ｍｉｎ，好像有点偏长，我是10ｍｉｎ。
3、TdT反应步骤我是2小时。而且之前最好加一步： 3% H2O237度孵育 30 minutes to block endogenous peroxidase activity。
4、还有你的反应液是不是新鲜配的，而且要新鲜配后置冰浴中保存备用。这也是一关键。
小问题是：你的DAB是即用型的还是要配的，建议用即用型的，以免失败在小环节上。
心肌缺血再灌的凋亡免疫组化的几个问题
reaction：我准备做大鼠离体全心缺血再灌的凋亡检测。听说心肌的凋亡Tunel不好检测，杭州联科生物技术有限公司的Tunel试剂盒说心脏组织细胞数多，破膜困难，使用两个破膜剂，不知怎样配？丁香园的参考说：蛋白酶K20ug/ml，室温15分钟，我看做心肌的文章用这个浓度的凋亡指数多不高，是不是破膜困难？若没有两个破膜剂，用50ug/ml的蛋白酶K37度15分钟是不是较理想，因为我发现用此剂量的文章的心肌凋亡指数比较高。博士德的Tunel试剂盒蛋白酶K够此剂量吗?
文献上凋亡的计算方法多为：光镜下200倍放大，经图像分析仪随机选择10个视野，检测阳性染色平均光密度(MOD)、阳性表达面积率(阳性核总面积占视野中所有细胞核总面积百分比)计算：细胞凋亡指数(AI)：AI(%)=MOD×表达面积率×100。也有的文章不乘平均光密度，直接算核的百分比，哪一种更科学？另外我看讲究的文献还要用相邻切片HE染色来确定排除内皮细胞和成纤维细胞，或用抗心肌结蛋白的抗体进行双标，若上两方法我都无法实现，文章的份量会受影响吗?
还有因经费紧张，Tunel每组做6张切片，每只大鼠做一张，可以吗？
心肌石蜡切片的Bcl-2文献多用1：100的一抗浓度，我已经用晶美的Bcl-2 1:70 染了几张DAB显色的石蜡切片，bcl-2蛋白的在85％以上的缺血再灌组心肌表达，肉眼看不出保护性药物组与缺血再灌对照组的区别，感觉是肌纤维的非特意性染色。是不是一抗浓度太高，抗原修复过了？请告诉我bcl-2与bax的浓度，孵育时间。
happypeng1193：4 μm石蜡切片常规脱蜡至水，
PBS洗 3×3min
3%H2O2处理， 20min， 室温
蛋白酶K 20μg/ml 20min 37℃
PBS洗 3×3min
Tunel混合液
A液: 1ml TDT Buffer×1+10μl TDT
B液：10μl biotin-dNTP
编辑： xywym_78 作者：佚名
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