丁香通

7、DAB显色5~10min，自来水冲洗，

8、苏木素复染，盐酸酒精分化20s，自来水冲洗20min，

9、梯度脱水50%，70%，80%，90%，100%（1），100%（2），2min/次

二甲苯透明两次，10min/次，中性树胶封固，镜下观察。

大灵通：

我想做细胞爬片，然后加不同浓度促进凋亡的药物，然后做 TUNEL检测凋亡情况。问题有二：

1、随药物浓度升高，凋亡比例越来越高（我做流式得到的结论），可是很多调亡细胞都漂了，那会不会影响TUNEL结果？不知道我说明白没有？就是说虽然调亡细胞增多，可是漂的越来越多，玻片从培养液里拿出来细胞都留在培养液里了！可是文献上也都是这么做的呀。他们的细胞难道凋亡了也都留在片子上的么？

2、在用4%多聚甲醛固定细胞时，4%多聚甲醛是4度的还是常温的？我用的是博士德的试剂盒，没说要4度，文献上有的写用，有的没提，我到底用不用呢？

zhaoqingshan：其实，确实是这样的，凋亡的细胞在开始走向凋亡的通路的时候，也许在分岔口就已经脱离贴壁了。有两点建议：

1、据说国产的TUNEL试剂盒质量不太好，我以前用的是Roche的；

2、4%多聚甲醛用常温固定15-20分钟即可；

3、显然，凋亡的细胞大多数已经脱离玻璃片了，所以应该把漂浮起来的细胞收集，然后甩片粘在玻璃片上，才能充分说明问题。

4、Tunel最后还得采用图像分析的办法计算结果，比较主观，只能算是半定量。你也可以用Tunel试剂上流式啊！

大灵通：TUNEL最后是要做记数的，如果随药物浓度升高细胞凋亡增多，但却都漂了。举个例子，比如在A浓度时细胞实际凋亡40%，B浓度时细胞实际凋亡80%，但是因为很多凋亡细胞漂起来了的，很可能最后发现B浓度的片子反而凋亡数少，因为细胞都跑了。甚至B浓度时片子上都没有什么细胞了呀！如果要收集漂的细胞，那以什么比例往片子上涂？因为这涉及最后凋亡的比例呀。而且文献上对于细胞爬片没有这么做的，都是捞出片子就做固定，甚至还有用PBS洗5分钟再固定的，难道他们就没有我的问题？

zhaoqingshan：不做爬片不行吗？做流式啊！虽然，我也接触图像处理和分析不少时间，个人认为还是比较主观的。做几个爬片当样子，出几张漂亮点的图就行了。

wangzhang：能否摸索一下固定的时机呀，也就是说，细胞凋亡是有一个过程的，可不可以，分不同的时段固定，比较一下，在什么时候固定的细胞脱落的又少，还能看出不同呢。一定要用TUNEL看爬片吗？我曾将药物处理过的细胞离心后，悬于Hochest33258,如果药物的凋亡作用明显的话，也能很好的看出来。

大灵通：流式我已经做完啦，是用PI染色的。共5个药物浓度组：0，5，10，20，40，都是作用24小时。我发现随药物浓度升高，凋亡比例不断增加。

除了流式，TUNEL也是我实验的一部分。我就是想用细胞爬片做TUNEL,也是5个药物浓度组：0，5，10，20，40，也是作用24小时，观察凋亡比例。在做流式的时候我就发现：随浓度升高，漂的细胞不断增加，凋亡比例也不断增加。因为做流式是不怕细胞漂的（最后收集瓶内所有细胞上流式细胞仪），可TUNEL就不一样啦！

你看我这样行不，药物作用到时间后，轻轻从孔里取出玻片（我用的是12孔板内放小玻片的方法），尽量不晃动，使漂的细胞也被带上来一部分，然后立即固定。

每个浓度都这样操作，虽然不太正规，但象青衫说的那样，会出几个好片子，凋亡比例我心里有数哇！要不还有啥办法呀？

zhaoqingshan：那样是不行的，因为不洗掉血清的话，固定的时候会很难看的，而且血清中的蛋白会黏附在细胞上被固定了。

zhizuchangle：也即将做TUNEL了，我可能也会遇到类似大灵通的问题，我打算用96孔板做TUNEL,这样可以节省试剂，象大灵通所说的，冲洗时会把凋亡的细胞一起洗掉，确实很让人头疼，这个问题应该如何解决啊，

victoh：（TO 大灵通1、）实际上TUNEL更大的意义在于检测体内凋亡，若做体外定量研究贴壁生长的细胞时，应该将悬浮的细胞收集起来，不过这样统计起来较为麻烦，当然可以分别计数贴壁/悬浮的细胞数量，培养细胞做TUNEL主要用于定性的研究。

（TO 大灵通2、）我平时将PFA置于4度冰箱内保存，用时取出即用

用TUNEL检测细胞凋亡，想比较各组的凋亡率的差别用什么统计方法

pengwenf09: 请问，用TUNEL检测细胞凋亡，因为是率的比较。应该用卡方检验，但如果我想比较两两之间的差别又该用和种检验呢？

maokai123: 是不是t检验

pengwenf09: 我觉得是不是更应该用单因素方差分析。

maokai123:查查excel的帮助吧 里面有比较详细的推荐。不就是比较两组样本差异在一定置信水平下的显著性吗？你看看excel推荐的函数 直接套用就好了。

鄱译问题

武林高手：那位高手帮助翻译一下：

TUNEL staining was performed according to supplier directions using in situ cell death detection kit,fluorescein (Boehringer Mannheim). Sections were deparaffinized,rehydrated, and washed with PBS for 10 min followed by washing with permeabilization solution (0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate) for 5min and then washed twice with PBS. Sections were then incubated with labeling solution (Boehringer Mannheim) for 1 h in humid chamber. After three washes with PBS sections were blocked in blocking solution supplied by the Zymed kit for 30 min. Sections were incubated overnight with rabbit anti-ErbB-4 antibodies at a final concentration of 1:100. Following three washes with PBS, sections were incubated with rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:100 final dilution) for 2 h, washed, and mounted for immunofluorescent microscopy.

Tunel后在封闭液中封闭30分钟Why?用的是什么封闭液？situ,permeabilization,Triton是什么意思？

qxm：in situ ：在原位，原处。permeabilization：破膜，在细胞膜上打孔的意思。 TRITON就是用来破膜的

jpxq：翻译如下，不妥之处请纠正：

按照试剂说明书用原位细胞死亡检测试剂盒进行TUNEL染色。荧光素(Boehringer Mannheim公司提供). 切片脱腊入水，用PBS洗。10min后用通透液0.1% Triton X-100, 0.1%枸橼酸盐）通透5min（破膜），然后用PBS洗2次。切片置于湿盒用标记液(Boehringer Mannheim公司提供)孵育1h。用PBS洗三次后切片用封闭液（Zymed试剂盒）封闭30分钟。切片与终浓度为1：100的 rabbit anti-ErbB-4 抗体孵育过夜。PBS洗三次，切片和罗丹明标记的羊抗兔IgG（终浓度为1：100）孵育2h，洗后用荧光显微镜计数检测。

另外，因为检测系统用到了生物素标记（文中没有提供），所以封闭液是为了封闭外源性的生物素。

zhongweigao01：基本赞同jpxq的翻译：是的 ，tunel的检测是在 标记液 后用【内源性】的生物素的封闭液的（不是外源性），即Zymed试剂盒

xwwq: 如何翻译TUNEL（terminal dUTP-biotin nick end-labeling）技术

pengding3: dUTP-生物素粘性末端标记技术