TUNEL方法检测凋亡的讨论-丁香通-专业生物医药商业信息平台

TUNEL方法检测凋亡的原理

ljksbs ：细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.

TUNEL细胞凋亡详细流程

youngtiger：

TUNEL法原位标记凋亡检测试剂盒

细胞发生凋亡以后，出现多个生物学改变特征，如：细胞膜、染色质凝集、核DNA断裂等等。目前DNA断裂检测是一种广为认可的检测凋亡的方法，这种检测可以通过提取细胞DNA进行凝胶电泳来完成，也可以进行原位检测，即常说的TUNEL（TdT介导的dUTP缺口末端标记技术）方法。

TUNEL方法的基本原理如下：在TdT酶的作用下，将生物素或者溴标记的核苷酸连接到细胞内断裂DNA游离的3'OH上，然后加入酶标的链霉亲和素或者抗标记核苷酸的抗体，达到原位检测目的。

试剂盒简单操作步骤：

细胞或组织片固定（中性固定液，如3.7％甲醛）

水化（样本依次在100%、95%、70%的乙醇处理）

PBS浸泡

蛋白酶K处理标本（蛋白酶K主要应用于组织样本和对照片，Cytonin用于新鲜准备的细胞样本）

双蒸水（dH2O）洗涤

3%H2O2甲醇溶液（Quenching solution）消除内源性HRP

PBS中洗涤

1XTdT标记缓冲液孵育

TdT标记Biotin-dNTP（TdT标记反应混合物）

终止标记反应（1XTdT Stop Buffer）

PBS洗涤

Streptavidin-HRP孵育（若使用荧光标记的Streptavidin，则无需进行以下步骤，直接在荧光显微镜下观察）

PBS洗涤

DAB溶液显色

去离子水中洗涤

甲基绿溶液复染

使用TUNEL试剂盒基本注意事项：

避免将试剂盒保存于无霜冰箱中

使用PH中性的固定液固定组织或者细胞，避免使用酸性或者碱性固定液，以免出现认为DNA损伤；推荐使用 3.7％甲醛溶液）

在操作过程中避免出现干片现象

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