丁香通

wangyibo：孵箱内托盘的水中加一些硫酸铜可抑制霉菌。

无影剑客：做原代培养，20多天后已经传代或要传代时几瓶细胞均出现局部黏附在在瓶底的葡萄状漂浮物,摇晃后会有部分脱落。有两瓶突然出现浑浊，镜下找不到细菌。换液后漂浮物较前增多。疑为霉菌污染。原代培养做的好辛苦，突然发现大面积污染，最近一两个月的工作就要化为乌有。请教已经出现的污染有没有办法弥补。两性霉素B如何配制、贮存及污染后的最大应用剂量。

youngtiger：做原代培养出现污染原则上应遗弃细胞，但鉴于你的个人原因及我以往排除污染的经验，现给出以下建议：两性霉素，浓度范围1-50ug/ml，常用浓度3ug/ml；制霉菌素，浓度范围1-500U/ml，常用浓度50U/ml。两者任选其一。

Pathway：建议楼主楼主试一试用96孔(或48孔)细胞培养板来培养;这样局部的、偶然的污染不会使实验全军覆没。因为我也经常要做原代培养，一般会同时接种细胞培养皿和96孔板。因而有时会出现这样的情况：5块96孔板总共只有4、5个孔污染了，但所有的细胞培养皿都污染了。从来没有发现细胞培养皿没有污染，但96孔培养板却污染了（至少目前是这样）。对有污染的培养孔，我一般用8M的NaOH处理（加热至70－80度，污染也从来就没有扩大过）。总之，原代培养出现的污染多是机会性、偶然的，使用96孔或48孔细胞培养板是一种很好的控制污染的手段。（说到底是一种机械的、行之有效的隔离措施）

loyal1006：已出现污染一般是无法挽救的，两性霉素、制霉菌素也只能是预防污染，或许在污染的早期还有一点作用。目前关键是要找到污染源，以防下次再污染。

qingshi：这段时间大量养细胞，呵呵，880多个，那个多呀，可是竟然出现霉菌和酵母污染，于是，消毒处理，可是，污染照旧，于是大胆决定，撤掉水盘，呵呵，果然效果良好，已经20多天了，一切正常，顺便说一下，我同时养的悬浮、贴壁。加入10ml培养液，3天换液，没问题。

Pathway：楼主不是同时养880种细胞吧？而是用了96孔培养板养了多种细胞吧？我觉得国内还没有那个单位和公司能同时养880种不同的细胞。另外，不要水盘的话，楼主怎么保证培养箱内的相对湿度呢？（培养箱内的高湿度和温暖的环境确实是最适合霉菌生长的），我的培养箱内也可见长有很多的霉菌，但会引起细胞培养瓶内的细胞污染的可能性却很小（即使使用细胞培养皿和细菌培养皿也是如此）；不过，由于我的培养箱可自动消毒，我一般每个季度都会消毒一次。

qingshi：no。贴壁细胞无法用96孔板，当然不会一次性培养880种，而是持续培养，一般维持在80多个，使用50ml的培养瓶。我也担心湿度问题，但是没什么大问题。

小毒物：我正在养细胞,一开始有10瓶,不断的养,不断的有真菌污染,现在剩下4瓶了.因为也并不是所有细胞都出现污染,大家帮忙分析一下应该注意哪些问题?

juju：真菌污染是细胞培养过程中常见的问题。首先，环境需要清洁，超做台每天用新洁尔灭清洗是必要的。然后在培养基中适量添加制霉菌素，和两性霉素可以抑制真菌及其他霉菌的生长。再者，超做时加以注意。应该对你有帮助的。细胞培养过程中常见的问题建议你可以看看“细胞培养实验指南”一书。里面有更详细的讲解。

mlfyandw2002：最好的方法就是丢掉它,然后用甲醛熏蒸,再就是集体放假一个星期.再回来重新做过.

小毒物：谢谢两位,我已经将孵箱用甲醛熏过一次了,每次照台子之前用酒精擦台子,紫外线照30分钟,操作也很注意,但还是不能幸免遇难,看来要加制霉菌素等试试看了

fairyland：最近培养筛选细胞频频污染，以前操作还没有现在认真，细胞一样长势旺盛，一点问题也没有。现在越是小心谨慎，却总是污染，即使第一二天没有污染，时间稍长就出现了。其它同学有时有，但我出现的次数最多。一种是一小团一小团褐色成致密网状，一种是如同芽孢状，一串一串的。细胞筛不出来后面的试验根本就无法进行，真是心急如焚，大家帮帮忙吧！

gsy1234：严格保证泡酸，消毒过程！，换血清和重新配培养基！我有过类似经历！这样处理后就没出过问题！舍不得孩子套不住狼！麻烦一点，总比浪费时间和金钱重要！

weric：你的问题很严重, 且强烈怀疑有fungi 污染(是如同芽孢状，一串一串的), 所以根本解决之道, 先把 CO2 incubater 以酒精和抗 fungi 药物擦拭, 铁盘拿去灭菌. 然后所有 mdium PBS 重新配制, 最后重新解冻新细胞来培养

zhizuchangle：最好来一次彻底清洗，包括培养箱水盘和无菌室，所养的细胞全部高压后弃去，水盘别忘了加点硫酸酮，可以防霉菌。若是怀疑培养液污染，可以在每次配液时先装一小瓶观察，直到确定无污染再使用！

ssmu_fruit：不必太紧张,这种经历养细胞者一般都会有。瓶口不要太松(防止孢子飘入),放入培箱前瓶口烧一烧,瓶身用酒精棉擦拭一下。培基等过滤过的液体不必扔掉(0.22um),没有问题。培箱开启前大家都用酒精消毒手,避免不必要的污染。要保证冻存的细胞未经污染.

紫水晶：我最近养CHO-HUK细胞，这一个月来总是污染，有时是细密的东西，像是细菌；有时是霉菌，刚过滤的2000ml培养基都污染了，可以明显看到白色的菌落生长；再就是我的胎牛血清过期了一个月，发现里边有许多漂浮的异物，在镜下看是许多弯曲的东西，在孵箱里培养一天便混浊，应该也是细菌污染。我想请问：血清过期和污染有没有必然的联系？在这样潮湿闷热的天气里应该怎样预防和控制污染，大家有什么好办法？

little_G：可能的原因：

1、天气太热，实验者在培养和接种或者换液时出汗（有空调稍好，但是手也出汗）。

2、培养间里可能暗藏污染原。

3、注意培养箱（这点最重要），仔细检查培养箱里的隔板的下面，有可能有霉菌斑。（我遇到过）

4、培养基污染多数是配置过程中造成的，仔细检查配置过程用到的器具。

5、血清过期一个月，如果保存的好应该没有问题，但是保存不好，新来的血清，用一次就可能污染。血清过期和污染是否有必然的联系不好说，个人体会觉得其联系不大。

解决办法：

1、彻底清洁培养间，显微镜室。然后，紫外灯多照射一端时间消毒空气。

2、彻底清洁培养箱：（1）每个隔板仔细清洗，火烤。（2）培养箱大换水，换成新鲜干净的蒸馏水。（3）培养箱内壁用酒精棉球或者稀过氧乙酸认真擦洗。（4）紫外灯长时间照射（一天）。

3、实验用器械消毒：注意消毒时间和压力，有必要检查压力锅和校正压力表是否准确。

4、一次性手套在打开使用前一天放入无菌间照射消毒。

5、如果用双抗，应该现用现配。

6、注意过滤器的消毒灭菌。

7、过期的血清，可以做培养检查是否被污染。如有怀疑，建议不用。

8、检查培养间和超净台的通风过滤网，如果脏了，需要更换。

总之，潮湿闷热天气培养细胞非常容易污染，必须注意每一个环节。具体的可能造成污染的环节，还得要自己体会查找。

hdfi8d：

1、用碘伏仔细擦洗浮箱和操作台，地面，然后用紫外灯照1小时

2、处理完细胞放回浮箱是用酒精棉擦培养瓶的底部

happywind：我的一瓶价钱不是很贵的血清，用后总是发现培养基中有很细小的类似细菌污染的东西，但是培养液又不很快变浑，不像细菌污染，细胞长的也慢，现在想想也许就是血清的问题吧，养细胞血清的选择还是很重要。

避免污染，我认为：

1、每次做完实验，超净台要用酒精喷擦；打开紫外线照射；

2、严格无菌操作；

3、孵箱定期清洗，换水；

4、每次观察细胞后，酒精喷瓶口；

5、培养瓶最好放在一个托盘上，然后在放入孵箱。托盘是高压蒸汽消毒过的。

limengqiang：防止细胞污染很简单，只要按照外科手术的操作原则进行无菌才操作，保证污染不了。

olivezrp：还有 一个 问题，就是血清用之前是否灭活过。很多公司的血清 ，分装 之前 需要灭活，不是一定要灭活 的，但如果 你 没有 灭活，即使没有污染，镜下也 可见 许多 漂浮物，一般为 衣原体、支原体等，建议血清分装前，56度水浴 灭活30分钟。

guanping：倒置显微镜一般是看不到"许多 漂浮物，一般为 衣原体、支原体等"的,关于血清污染:买回来后(进口的一般不需要灭活),溶解后分装一小瓶,培养箱里72 h 以上,即可看到污染与否(没有污染的应该是透明度很好的).如果有问题,就退货,没有话说.如果发现溶解后即可看到明显的漂浮生物,呢就不用我说了。使用过程中,最好分成小瓶,用个1 周左右,4 度保存!反复冻融,对其效果和性状有影响.

brisk2004 ：我最近也碰到了这样的问题，养的815细胞总是污染，把培养基，胰酶等什么都丢了也不行，后来我发现培养箱里面长霉了，清洗灭菌之后才没事了。