编者按：
 

做科研的广大研究者们都知道，科研样本对于我们的研究起着决定性的作用。对于我们来说每个样本都是独特的、珍贵的、甚至有些样本是非常难获取的，或许有时候的损失可能会带来延期、重制样、甚至错失发文先机。

本篇运用 PCT-DIA技术，可以快速稳定地将微量样本转化为一份数据文档，永久地存贮这个样本经质谱分析得到的蛋白质组结果。

 

什么是PCT

 

PCT是一种样品蛋白质组处理技术，通过在超高压和环境压力之间程序性周期性变换，诱导样品的基质和蛋白质溶解，促进并加速蛋白质酶解。对于临床样本，PCT还可以灭活潜在的传染微生物。PCT技术具有速度快、损失少、操作简便、保真度高等特点。

 

PCT的优势及应用

1、可处理特殊、珍贵、微量样本：（FFPE样本蛋白质组学）石蜡包埋样本(1mg)、甲醛固定样本(1mg)、临床活检样本(1mg)、微量细胞样本（50万）、花粉/鱼苗等（1mg）；

2、高效的酶解效率

3、损失少：PCT处理1mg样本（如小鼠肝脏）的产率高出传统方法的40%；

4、操作简便：比传统样本处理方法减少近10步骤，仪器操作简单，误差小；

5、保真度高：Barocycle（超高压循环破碎仪）精确控制，有效地减少操作误差。
 

图 | PCT辅助组织裂解和蛋白质酶解的肽段产量和效率

 

参考文献：

Rapid mass spectrometric conversion of tissue biopsy samples into permanent quantitative digital proteome maps. Nat Med. 2015 Apr;21(4):407-13.

 

什么是DIA

 

到目前为止，蛋白质组学分析主要采用数据依赖采集（data dependent acquisition，DDA）和数据非依赖采集（data independent acquisition，DIA）两种质谱扫描模式。

 

DDA选择一级质谱中相对高峰度离子进行高能碰撞碎裂，产生的碎片离子送入二级质谱检测。

 

DIA将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂及检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。因此在定量准确性和重复性上都要优于DDA模式，且能够定量到更多的低丰度蛋白。DIA也正是因为这种全扫描方式，导致DIA模式产生的碎片离子谱图过于复杂，难以通过与目前数据库中理论图谱直接匹配的方式得到蛋白定性的结果。因此目前常用的解决方法是利用DDA扫描模式建立样本的参考库，对DIA的数据进行分析来做定性和定量。

 

DIA优势：

1. 稳定性强，重复性高：对液相色谱串联质谱的稳定性和重复性要求较高，鉴定与定量结果的可重复性高；

2. 耗费低：无需使用昂贵的同位素标签，实验耗费低；

3. 易操作，样本不受限：前处理操作过程较少，使样本最接近原始状态，同时不受样品条件限制；

4. 通量高：不受样品个数的限制，可用于大规模样本数量检测；

5. 减少了低丰度母离子和碎片离子的丢失，大大提高了高分辨质谱二级定量的通量；

6. 准确性高：实现了全景式准确的定量；

7. 可以获得检测到的所有蛋白的定性和定量信息。

 

DIA原理
 

 

DIA比DDA更稳定、更准确
 

 

 

参考文献

Gillet, L. C. et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol. Cell. Proteom. 11, O111.016717 (2012)

  

DIA更快、更多

 

在定量到相同数量的情况下（iTRAQ进行了分级（SCX分6级），以达到跟DIA相同的鉴定数量），DIA能够定量到更多的低丰度蛋白。
 

 

参考文献：

Trayambak Basak,Ajay Bhat,et al。In-depth comparative proteomic analysis of yeast proteome using iTRAQ and SWATH based MS. Mol. BioSyst., 2015,11, 2135

 

PCT-DIA结合

 

PCT技术可最大限度地减少样品的处理，并且使样品损失最小化，可处理低量的珍贵样品。DIA技术无通量限制，可用于大规模样本数量检测。将这两种技术强强结合，可实现针对石蜡/甲醛处理的组织样本及微量样本的蛋白组学分析，运用其通量高、稳定性强、速度快和精度高的特点，可解决微量样品难以分析蛋白质组的技术难题。
 

PCT-DIA应用范围：

样品量少或者样品数量多皆可用PCT-DIA技术进行蛋白质组学研究~~
 

应用领域：

临床疾病标志物的筛选

作用机制研究

药物作用靶点研究

疾病的分子分型等...
 

 

下面以一篇实用案例，以6个样本为例，详细地介绍了PCT-DIA技术的实验步骤。

 

本篇由苏黎世联邦理工学院Ruedi Aebersold教授团队在Nature Medicine杂志（IF=30.641）发表题为“Rapid mass spectrometric conversion of tissue biopsy samples into permanent quantitative digital proteome maps”的研究论文，该研究提出了一个方法，可以快速稳定地将微量样本转化为一份数据文档，永久地存贮这个样本经质谱分析得到的蛋白质组结果。
 

基本信息

【材料】组织活检样品 

【主要技术】PCT-DIA(SWATH)技术

【期刊】Nat.Med.

【影响因子】30.641

 

技术路线

1、建立PCT-DIA(SWATH)工作流程；

2、质谱分析；

3、利用PCT-DIA(SWATH)检测肾组织中蛋白质的动态范围；

4、PCT-DIA(SWATH)检测肾组织蛋白质组的变异分析；

5、利用PCT-DIA(SWATH)进行肾肿瘤活检分型；

 

PCT-DIA实验步骤（以6个样本为例）

步骤1：组织溶解与蛋白提取

将一批6个活检组织放入试管中并在Barocycle（超高压循环破碎仪）中裂解。
 

 

 

步骤2：蛋白酶解

提取的蛋白质被还原和烷基化并稀释，利用Barocycle（超高压循环破碎仪）促进酶解反应，C18柱脱盐，真空干燥。总耗时约6小时。
 

 

 

步骤三：混样DDA建库

混合样品经过SCX分级，利用DDA扫描模式建库。
 

 

 

步骤四：DIA-MS分析

使用DIA扫描模式（即SWATH）进行谱图信息采集。
 

 

步骤五：图谱分析

将DIA扫描模式下获得的图谱信息与DDA建库信息进行比对，通过一系列的数据处理手段，获得蛋白定性和定量信息。
 

 

 

结果展示
 

图1 |不同技术重复之间的中位数变异系数（CV（%）<24%）
 

图2 |PCT-DIA技术验证其他文献中已发表的蛋白质标志物

 

图3 |组间和组内的变异系数

 

 

 

小鹿推荐
 

PCT技术是一种基于循环超高压的快速破碎微量样品的技术。具有速度快、损失少、操作简便、保真度高等特点，结合SWATH（DIA模式）的全范围扫描技术，特别适合大队列（几十上百甚至上千个样品）、少量样品（比如组织活检样品）蛋白组批量分析。文章采用PCT-SWATH技术，不仅能区分健康组织和肿瘤组织，还能实现对癌症的分子分型。该方法还可以应用于药物功能分析、分子功能分析等多个研究领域，是从蛋白组层面进行大队列分析的理想方法。

 

 

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